Microbiology

Некоторые микроорганизмы, образующие при брожении кислоты, объединяют в одну физиологическую группу на том основании, что характерным, хотя и не главным продуктом брожения является у них муравьиная кислота. Наряду с муравьиной кислотой такие бактерии выделяют и некоторые другие кислоты; такой тип метаболизма называют поэтому муравъинокислъш брожением или брожением смешанного типа. Так как некоторые типичные представители этой группы обитают в кишечнике, все семейство носит название Enterobacteriaceae. Это грам-отрицательные, активно подвижные, не образующие спор палочки с перитрихальным жгутикованием. Будучи факультативными аэробами, они обладают гемопротеинами (цитохромами и каталазой) и способны получать энергию как в процессе дыхания (в аэробных условиях), так и в процессе брожения (в анаэробных условиях). В отношении питания эти бактерии исключительно нетребовательны - растут на простых синтетических средах, содержащих минеральные соли, углеводы и аммоний. Сбраживание глюкозы у всех представителей этой группы происходит с образованием кислот. Значение Enterobacteriaceae для эпидемиологии, а также для разного рода экспериментальных исследований общеизвестно; поэтому полезно будет рассмотреть здесь некоторых представите лей этого семейства.

Наиболее важные виды. Escherichia coli- обитатель кишечника, в количественном отношении, однако, не главный (в кишечной флоре пре обладают Bacteroides и Bifidobacterium). Эта бактерия может некоторое время сохранять жизнеспособность и вне кишечника, и ее легко выявить. Этим пользуются для того, чтобы обнаружить загрязнение питье вой воды фекалиями.

Proteus vulgaris тоже принадлежит к нормальной кишечной флоре, но, кроме того, широко распространен в почве и воде. Эта бактерия известна своей склонностью к изменению формы (отсюда ее название) и большой подвижностью, а также способностью образовывать на поверхности агара сплошную пленку.

Enterobacter aerogenes можно в известном смысле считать «близнецом» Е. соli (оба вида относят к «группе кишечной палочки»). Эта бактерия широко распространена в почве; как показывает ее видовое на звание, она образует много газообразных продуктов. От Е. coli она отличается лишь немногими биохимическими признаками (см. табл. 8.4 и 8.5).

Serratia marcescens (прежнее название - Bacterium prodigiosum, или чудесная палочка) может рассматриваться как вариант Enterobacter, отличающийся образованием пигмента.

К роду Erwinia относятся некоторые фитопатогенные виды, поражающие стебли, листья и корни. В результате выделения пектиназ они вызывают мягкие гнили.

Klebsiella pneumoniae отличается от Enterobacter только более толстой слизистой капсулой и неподвижностью. Ее находят при некоторых тяжелых формах пневмонии.

Salmonella typhimurium - самая распространенная из бактерий, вызывающих гастроэнтерит, или так называемую «пищевую токсикоинфекцию»; в основе симптомов лежит раздражение слизистой желудочно-кишечного тракта выделяемыми липополисахариднымй токсинами бактерии.  В  кровяное  русло  возбудитель  не  проникает.  S.  typhi является возбудителем эпидемического брюшного тифа, a Shigelladysenteriae и родственные штаммы-возбудителями дизентерии.

Vibrio cholerae - возбудитель холеры, эпидемической болезни. Он не относится к группе Enterobacteriaceae, но близок к ней по типу метаболизма. Холерный вибрион размножается в кишечнике. Он прикрепляется к кишечному эпителию, но не проникает в клетки. Холерный энтеротоксин - белок, связываемый клетками кишечного эпителия (специфическими рецепторами). Он вызывает переход воды и ионов натрия, бикарбоната и хлорида в просвет кишечника.

Yersinia pestis-возбудитель чумы. Род Yersinia не относится к таксономической группе Enterobacteriaceae, но близок к ней по своему факультативно-анаэробному образу жизни и по типу брожения. Природным резервуаром этого возбудителя эпидемий служат дикие грызуны, главным образом крысы. Бактерии передаются человеку инфицированными блохами и другими эктопаразитами; в результате развивается бубонная или легочная чума. Быстрое размножение бактерий в организме и интенсивная выработка ими токсина могут приводить к скорой смерти.

Анализ питьевой воды. Основная цель анализа питьевой воды - обнаружение Escherichia coli. Этот анализ-простой пример бактериологической дифференциальной диагностики, поэтому на нем стоит остановиться подробнее. Е. coli-обычный и совершенно безвредный обитатель кишечника человека, и его присутствие в питьевой воде само по себе неопасно. Однако в кишечнике может находиться и ряд патогенных бактерий. Вместе с Е. coli эти бактерии выделяются с калом больных, реконвалесцентов и бациллоносителей, так что и они могут попадать в питьевую воду. Чтобы не применять специальных методов для выявления каждой из таких патогенных бактерий, пользуются общим индикатором загрязнения. Таким индикатором и служит постоянный обитатель кишечника Е. coli. Обнаружение этого вида в пробе воды показывает, что вода загрязнена содержимым кишечника и кишечными бактериями, среди которых могут быть и патогенные формы. В таком случае требуется принять соответствующие меры. Нормой для питьевой воды считается, когда общее число бактериальных клеток в 1 мл не превышает 100; при этом в 100 мл воды не должно быть ни одной клетки Е. coli.

Е. coli хорошо растет на средах, содержащих глюкозу или лактозу и пептон. Для того чтобы создать условия, при которых рост других бактерий сводился бы к минимуму, пользуются лактозой. На средах с лактозой могут расти только те бактерии, которые способны ее расщеплять с помощью р-галактозидазы. Этот фермент синтезируют бактерии группы кишечной палочки и молочно кислые бактерии, тогда как многие почвенные и водные бактерии его лишены.

Первые указания на присутствие газообразующих бактерий дает появление газа во время инкубации пробы в растворе с лактозой и пептоном в бродильных трубках Эйихорна. Если в одну трубку высеять Escherichia coli,а в другую - Enterobacter aerogenes, то уже после 24-часовой инкубации при 37°С станет заметной разница в выделении газообразных продуктов. Е. aerogenes оправды вает свое название и образует примерно вдвое больше газа, чем Е. coli. Различен и состав выделяющегося газа: Е. coli выделяет Н₂ и СJ₂ примерно в соотношении 1:1, тогда как Enterobacter aerogenes образует больше СО₂, чем водорода.

Некоторые молочнокислые бактерии тоже обладают способностью расщеплять лактозу с образованием газа, так что их присутствие может исказить результаты анализа. Это делает необходимым применение дальнейших методов дифференциации. Если такую культуру высеять на агар с эозином и метиленовым синим (лактоза-пентон-эозин-метиленовый синий), то появляются колонии Е. coli, окрашенные в темно-синий цвет с металлическим отливом (результат отражения света); Enterobacter же образует розовые слизистые колонии без металлического блеска.

Для более точной дифференциации этих двух микроорганизмов требуется полный анализ брожения. Это, конечно, самый точный, но и самый трудоемкий способ. В повседневной практике для заключительной дифференциации используют метод, основанный на качественных различиях между двумя рассматриваемыми видами бактерий (табл. 8.5). Учитываются следующие показатели: 1) образование индола из триптофана; 2) количество кислоты, образуемой из сахара (проба с метиловым красным); 3) образование ацетоина при сбраживании глюкозы (реакция Фогес-Проскауэра) и 4) рост на среде с цитратом в качестве источника углерода.

• 1. Образование индола. Индол, образуемый из триптофана, выявляется с по мощью реактива Эрлиха (и-диметиламинобензальдегида) по вишнево-красному окрашиванию.
• 2. Проба с метиловым красным. Образование кислоты приводит к изменению цвета рН-индикатора (метилового красного): красный <рН 4,5 < желтый.
• 3. Образование ацетоина (реакции Фогес-Проскауэра). Ацетоин, образовавшийся в питательной среде с глюкозой и пептоном, в сочетании с креатином, содержащимся в пептоне, вызывает после прибавления сильной щелочи (1 мл 10%-ного КОН на 5 мл питательного раствора) появление красной окраски. Чувствительность метода повышается при добавлении креатина и а-нафтола.
• 4. Использование цитрата. В синтетическом питательном растворе с цитратом использование последнего можно обнаружить по помутнению и подщелачиванию (выявляется с помощью бромтимолового синего).

Продукты брожения и метаболические пути. При брожениях, вызываемых факультативными анаэробами, в том числе представителями Enterobacteriaceae, многими видами Bacillus и другими бактериями, образуется большое число различных соединений, среди которых пре обладают органические кислоты. Важнейшими продуктами брожения являются уксусная, муравьиная, янтарная и молочная кислоты, этанол, глицерол, ацетоин, 2,3-бутандиол, СО₂ и молекулярный водород. Гексозы расщепляются в основном по фруктозобисфосфатному пути и только в незначительной части - по пентозофосфатному. Разложение глюконата идет по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути.

В зависимости от того, какие продукты брожения выделяются в анаэробных условиях, различают два типа процессов: а) при брожении, характерном для Escherichia coli, образуются главным образом кислоты и совсем не образуется бутандиол; б) при брожении, характерном для Enterobacter, основной продукт - бутандиол, кислоты же занимают второе место. В табл. 8.6 приведены результаты типичного анализа продуктов брожения. Два указанных типа брожения различаются главным образом по реакциям, связанным с превращениями пирувата.

Особенности брожения, осуществляемого Escherichia coli. Для этой бактерии характерны следующие особенности брожения; 1) расщепление пирувата с образованием ацетил-СоА и формиата; 2) разложение формиата на СО₂ и молекулярный водород; 3) восстановление ацетил-СоА до этанола; 4) отсутствие способности образовывать из пирувата ацетоин и 2,3-бутандиол.

Превращение пирувата в ацетил-СоА и формиат происходит только в анаэробных условиях; его катализирует пируват: формиатлиаза. Этот фермент чрезвычайно чувствителен к кислороду, удерживается флаводоксином в восстановленном состоянии и для своей активации нуждается в 8-аденозил-6-метионине.

Муравьиную кислоту большинство штаммов Е. coli и другие газообразующие виды энтеробактерий расщепляют на СО₂ и молекулярный водород.

Реакцию катализирует ферментная система, называемая формиатгидрогенлиазой. Речь идет, вероятнее всего, о комбинированном действии формиатдегидрогеназы (НСООН + X -» С0₂ + ХН₂) и гидрогеназы (ХН₂ -» X + Н₂). У Е. coli газообразные продукты Н₂ и СО₂ образуются почти в равных количествах. Такое стехиометрическое отношение (1:1) согласуется с образованием обоих газов в результате расщепления формиата. Однако при изменении рН это отношение меняется.

Этанол, образуемый энтеробактериями, является продуктом восстановления ацетил-СоА. У этих бактерий нет пируватдекарбоксилазы, декарбоксилирующей пируват с образованием ацетальдегида. Часть образующегося ацетил-СоА выделяется в виде ацетата; высокоэнергетическая связь может при этом сохраняться благодаря реакциям, осуществляемым фосфотрансацетилазой и ацетаткиназой.

Лактат получается в результате восстановления пирувата.

Сукцинат является продуктом «фумаратного дыхания», при котором происходит фосфорилирование, сопряженное с транспортом электронов. Сначала в результате карбоксилирования фосфоенолпирувата образуется оксалоацетат, который затем через малат превращается в фумарат. Фумарат при участии мембраносвязанной фумаратредуктазы восстанавливается до сукцината, который выделяется в окружающую среду. Выделение значительных количеств сукцината (табл. 8.6), синтез которого включает фиксацию СО₂, позволяет объяснить то, что Escherichia coli может покрывать за счет СО₂ до 20% своей потребности в углероде.

Особенности брожения, осуществляемого Enterobacter aerogenes. Эта бактерия в анаэробных условиях тоже образует целый ряд кислот; в количественном отношении они, однако, существенно уступают ацетоину и 2,3-бутандиолу. Ацетоин образуется из двух молекул пирувата. Процесс включает двукратное декарбоксилирование. Образование нейтрального продукта брожения - будандиола - в известной мере конкурирует за промежуточный продукт - пируват, подавляя тем самым синтез кислот.

С другой стороны, образование бутандиола связано с дополнительным освобождением СО₂. Количество дополнительно образуемой двуокиси углерода находится в стехиометрическом соотношении с коли чеством бутандиола. Из табл. 8.6 видно, что некоторая часть СО₂ образуется при расщеплении формиата, однако основное ее количество выделяется в процессе образования бутандиола. Своим названием Enterobacteraerogenes обязан, как уже говорилось, очень интенсивному выделению газообразных продуктов. Соответствующие отличия от брожения, осуществляемого Escherichia coli, составляют основу для применения пробы с метиловым красным и проведения реакции Фогес-Проскауэра на ацетоин.

Образование ацетоина у Enterobacter идет через 2-ацетиллактат. Активный ацетальдегид (гидроксиэтилтиаминпирофосфат) участвует в реакции с пируватом, катализируемой ацетиллактатсинтазой (ферментом I), в результате чего образуется 2-ацетиллактат:

Второй фермент - 2-ацетиллактатдекарбоксилаза - отщепляет СО₂. Продуктом этой стереоспецифической реакции является ацетоин (ацетилметилкарбинол).

2,3-Бутандиол образуется при восстановлении ацетоина бутандиолде-гидрогеназой:

СН₃- СНОН- СО-СН₃   +  NADH₂   -*-*  СН₃-СНОН^СНОН-СН₃   +   NAD

У Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, В. polymyxa, Serratia, Aeromonas hydrophila и некоторых других бактерий образование бутандиола идет через 2-ацетиллактат. Брожение с выходом бутандиола находит применение в промышленности.

При окислении ацетоина кислородом воздуха легко образуется сходное с ацетоином соединение диацетил. Его выделяют и различные молочнокислые бактерии (Leuconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum), добавляемые к молоку специально для этой цели в процессе приготовления молочнокислых продуктов (масла, йогурта). Диацетил придает продукту запах масла. У названных бактерий он синтезируется не через 2-ацетиллактат, а из гидроксиэтилтиаминпирофосфата и ацетил-СоА.