Microbiology

Выяснение механизмов, регулирующих биосинтез ферментов и их ак тивность, стало возможным благодаря выделению мутантов с дефекта ми регуляции. Выделены мутанты нескольких типов, в том числе: 1) не образующие функционально полноценного репрессорного белка или со держащие его в сильно повышенном количестве; 2) с оператором кон ститутивного типа, который не способен связывать репрессорный бе лок; 3) с аллостерической нечувствительностью, у которых опреде ленный фермент не может распознавать эффектор. Мы опишем некоторые методы,  с  помощью  которых  выделяют таких  мутантов.

Мутанты, конститутивно образующие катаболические ферменты. На копительные культуры такого рода мутантов можно получить путем частой смены субстратов. Если клетки конститутивно образуют фер менты, необходимые для использования субстрата А, то после переноса клеточной популяции с субстрата В на субстрат А они точас начинают расти с максимальной скоростью; клеткам же индуцибельного дикого типа для достижения максимальной скорости роста необходима опреде ленная лаг-фаза (чтобы синтезировать ферменты для роста на субстрате А). После ряда генераций клетки снова переносят на среду с субстратом В и дают им расти до тех пор, пока ферменты, участвующие в исполь­зовании субстрата А, не будут достаточно сильно «разбавлены». После многократного повторения такой процедуры конститутивные мутанты сильно обгоняют в росте клетки дикого типа с индуцибельными фер­ментами. Таким путем были выделены, например, мутанты Е. coli, кон ститутивно образующие ферменты, необходимые для использования лактозы. В других методах отбора пользуются таким приемом, как подавление индукции при помощи структурных аналогов субстрата. Метилтиогалактозид может, например, подавить у Escherichia coli ин дукцию да/-оперона, вызываемую галактозой.

Мутанты, конститутивно образующие анаболические ферменты. Эти мутанты, а также мутанты с нарушениями тонкой регуляции процессов биосинтеза могут быть выделены с помощью антиметаболитов.Многие антиметаболиты (разд. 6.6), будучи структурными аналогами нор мальных конечных продуктов биосинтеза (аминокислот, пиримидинов и т.п.), оказывают бактериостатическое действие. Имитируя конечный продукт, они, с одной стороны, нарушают синтез нормальных метабо литов, а с другой - включаются в белки или нуклеиновые кислоты, в ре зультате чего образуются макромолекулы, неспособные выполнять нор мальные функции. Ингибирование таким «ложным» конечным продук том приводит к остановке роста. Если на агаризованную среду с антиметаболитом высеять популяцию дикого типа (10⁸-10¹⁰ клеток), то способность к росту и образованию колоний проявят только от дельные устойчивые мутанты.

В основе подобной устойчивости к антиметаболитам могут лежать разнообразные изменения физиологических свойств клетки, обусло вленные мутациями. Рассмотрим типы таких мутаций.

• 1. Мутации, приводящие к «аллостерической нечувствительности». При такого рода мутации ни метаболит, ни антиметаболит не может подавить активность первого (аллостерического) фермента данного пу ти биосинтеза. В результате образование соответствующего конечного продукта не регулируется.
• 2. Мутации, приводящие к конститутивной дерепрессии. Следствие такой мутации-неконтролируемое образование ферментов, участвую щих в синтезе конечного продукта.
• 3. Мутации, затрагивающие каталитические центры ферментов, ак тивирующих метаболиты и участвующих в их превращениях. Вследствие повышения избирательности фермент может утратить способ ность связывать антиметаболит вместо метаболита. После этого антиметаболит уже не будет оказывать бактериостатического действия.
• 4. Мутации, приводящие к нарушению транспортных процессов. В результате таких мутаций антиметаболиты перестают поступать внутрь клетки и потому не могут уже влиять на ее метаболизм.
• 5. Мутации, обусловливающие конститутивное расщепление антиме таболитов. При этом клетка разрушает антиметаболит и тем самым обезвреживает его. С точки зрения отбора мутантов с нарушенной регу ляцией интерес представляют только первые два типа мутаций. Дере-прессия синтеза анаболических ферментов и утрата способности подчи няться аллостерическому ингибированию часто приводит к «перепро изводству» и выделению в среду конечного продукта данного биосинте тического пути (метаболита). Для мутантной клетки это существенно потому, что метаболит вытесняет антиметаболит из реакции, обеспечи вая таким образом рост клеток и образование колоний. Образующийся в избытке метаболит выделяется, диффундирует в агар и в зоне диффу зии устраняет влияние антиметаболита на клетки дикого типа. Такие клетки начинают расти и образуют мелкие колонии; их называют вто ричными или сателлитными колониями. Центральную же колонию образуют клетки мутанта, выделяющего метаболит (рис. 16.15). Рост сателлитов указывает на то, что произошла мутация, нарушившая нор мальную работу регуляторных механизмов. Но для того, чтобы устано вить, какого рода дефектом обусловлено накопление и выделение мета болита, в каждом случае требуется специальный анализ.

С помощью метода, основанного на применении антиметаболитов, уже выделено много мутантов с дефектами регуляции. При сравнении различных мутантов выяснилось, что утрата механизма репрессии мень ше влияет на скорость синтеза конечного продукта, чем изменение спо собности к аллостерическому ингибированию. У мутантов, не спо собных к ингибированию определенного пути биосинтеза, конечный продукт этого пути накапливается в клетке и часто выделяется в среду, несмотря на вполне нормальную репрессию. Напротив, у мутантов со значительной дерепрессией (конститутивностью) отмечается лишь очень небольшое накопление и выделение конечного продукта, если он оказы вает нормальное ингибирующее действие.  Таким образом,  репрессия

важна в первую очередь для уменьшения затрат, связанных с синтезом мРНК и белка, тогда как синтез метаболитов регулируется путем инги-бирования конечным продуктом.

Мутанты с измененной чувствительностью к эффектору. Мутантов, у которых изменена чувствительность какого-нибудь аллостерического фермента к эффектору, можно также выделять с помощью совершенно иного принципа, а именно как ревертантов к ауксотрофии. При этом поступают следующим образом. Сначала выделяют мутантов с дефек том регуляции, ауксотрофных в отношении метаболита, который хотят получить как конечный продукт, накапливающийся в среде. Затем среди этих ауксотрофных мутантов отбирают таких, у которых неспособность к синтезу данного метаболита обусловлена дефектом в аллостериче-ском ферменте соответствующего пути биосинтеза. После этого из по лученной мутантной популяции выделяют прототрофных ревертантов, которые не нуждаются в этом конечном продукте, так как сами спо собны его синтезировать. Среди ревертантов отбирают тех, которые выделяют нужный продукт в среду. Их можно выявить биоавтографиче ским методом (разд. 10.2.2) или распознать по росту сателлитных коло ний. О таком мутанте, полученном в результате двукратного отбора, можно составить себе следующее представление. У него после первой мутации перестал функционировать каталитический центр одного из ал-лостерических ферментов. Вторая мутация затронула структуру (кон-формацию) всей белковой молекулы, в результате чего каталитическая активность фермента восстановилась, но аллостерическая чувствитель ность оказалась утраченной. Как в этом, так и во многих других слу чаях для выделения желательного мутанта необходим ряд этапов, включающих мутагенез и отбор.

Теоретические и прикладные аспекты. Стратегия отбора мутантов весьма важна для дальнейшего изучения клеточного метаболизма и для выяснения механизмов регуляции. Вместе с тем эта стратегия имеет и практическое значение, так как именно она определяет пути целена правленного отбора высокоактивных продуцентов всех тех веществ, ко торые могут быть получены с помощью микроорганизмов.