Microbiology

Целлюлоза является главной составной частью всякого растительного материала, и синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений. Сохраняющиеся в почве и возвращаю­щиеся в нее растительные остатки на 40-70% состоят из целлюлозы. Столь большое количество целлюлозы в природе обусловливает важ ную роль разлагающих ее микроорганизмов в процессах минерализа ции и в круговороте углерода/

Целлюлоза состоит из цепочек p-D-глюкозы со степенью полимеризации около 14000. Физические свойства целлюлозных фибрилл (особенно их механическая прочность и нерастворимость) зависят не от структуры от дельных цепочек. Цепочки должны быть связаны между собой таким образом, чтобы гидрофильные группы были скрыты (это повышает стабильность). По данным рентгеноструктурного анализа, участки, имеющие кристаллическое строение, чередуются в целлюлозе с некристаллическими участками. Целлю лозные волокна представляют собой пучки фибрилл, одетые общей оболочкой, которая содержит воск и пектин.

Ферментативное расщепление целлюлозы осуществляется под воздей ствием целлюлазы. В экспериментах на грибах было показано, что в си стему целлюлазы входят по меньшей мере три фермента: 1) эндо-(3-1,4-глюканаза одновременно разрывает различные (3-1,4-связи внутри макромолекулы, что ведет к образованию больших фрагментов со сво бодными концами; 2) экзо-р-1,4-глюканаза отщепляет от конца цепочки дисахарид целлобиозу; 3) (3-глюкозидаза осуществляет гидролиз целло-биозы с образованием глюкозы.

В условиях лабораторной культуры микроорганизмы обычно синте зируют эти ферменты лишь в том случае, если целлюлоза-един ственный имеющийся субстрат. Их синтез подавляют как другие суб страты, так и продукт расщепления целлюлозы-целлобиоза.

Разложение целлюлозы в аэробных условиях. В хорошо аэрируемых почвах целлюлозу разлагают и используют аэробные микроорганизмы (грибы, миксобактерии и другие эубактерии), а в анаэробных усло­виях-в основном клостридии.

В аэробных условиях значительная роль в разложении целлюлозы принадлежит грибам. Они в этом отношении эффективнее бактерий, особенно в кислых почвах и при разложении целлюлозы, инкрустиро­ванной лигнином (древесины). Большую роль играют в этом процессе представители двух родов -Fusarium иChaetomium. Целлюлозу расще пляют также Aspergillus fumigatus, A. nidulans, Botrytis cinerea, Rhizoctoniasolani, Trichoderma viride, Chaetomium globosum и Myrothecium verrucaria. Три последних вида служат тест-организмами для выявления распада целлюлозы, а также при испытании средств, применяемых для пропитки различных материалов с целью предохранить их от действия микроор ганизмов, разлагающих целлюлозу. Грибы образуют целлюлазы, ко торые можно выделить из мицелия и из питательной среды.

Cytophaga и Sporocytophaga- аэробные бактерии, разлагающие цел люлозу. Их легче всего выделить обычным методом накопительной культуры в жидких средах. Эти два рода, близкие к миксобактериям, включают много видов. Об использовании целлюлозы миксобактериями и об их первичном воздействии на нее мало что известно. У них не удалось обнаружить ни внеклеточной целлюлазы, ни каких-либо про дуктов расщепления целлюлозы. Клетки этих бактерий тесно прилегают к волокнам целлюлозы, располагаясь параллельно оси волокна. По-ви димому, они гидролизуют целлюлозу лишь при тесном контакте с во локном, и продукты гидролиза тотчас же поглощаются. На агаре с цел люлозой колонии Cytophaga никогда не бывают окружены прозрачной зоной, в которой находились бы продукты ферментативного расщепле ния целлюлозы.

Кроме видов Cytophaga на целлюлозе могут расти миксо бактерии родов Polyangium, Sporangium иArchangium, образующие плодовые тела.

Использовать целлюлозу как субстрат для роста могут и многие из тех аэробных бактерий, которые можно было бы назвать «всеядными». Некоторые из них используют целлюлозу, видимо, только в тех слу чаях, когда нет других источников углерода; синтез и выделение целлю-лаз у таких бактерий регулируются по типу катаболитной репрессии. Некоторые формы, сходные с Pseudomonas, раньше объединяли в группуCellvibrio. Сейчас их описывают как Pseudomonas fluorescens var. cellulosa. Из коринеформных бактерий следует упомянуть Cellulomonas; эту бакте рию предполагали даже использовать для получения белка из целлю лозы.

Среди актиномицетов описано лишь немного целлюлозоразлагаю-щих видов: Micromonospora chalcea,Streptomyces cellulosae, Strepto-sporangium.

Разложение целлюлозы в анаэробных условиях. В анаэробных усло виях целлюлозу расщепляют чаще всего мезофильные и термофильные клостридии. Термофильный вид Clostridium thermocellum растет на про стых синтетических средах, используя в качестве субстрата целлюлозу или целлобиозу, а в качестве источника азота-соли аммония; глюкозу и многие другие сахара эта бактерия не утилизирует. Продуктами сбра живания целлюлозы являются этанол, уксусная, муравьиная и молочная кислоты, молекулярный водород и С0₂. Вне клеток целлюлоза расще пляется, вероятно, только до целлобиозы. К сходным продуктам приво дит сбраживание целлюлозы мезофильным видом Clostridium cellobioparum. Длинная палочкаBacillus dissolvens ведет себя подобно упомянутым выше видам Cytophaga: клетки этой бактерии тесно приле гают к волокнам целлюлозы и не выделяют в среду целлюлазы.

Микробиологические процессы в рубце жвачных животных. В рубце жвачных целлюлозу тоже расщепляют главным образом бактерии. Ос новными источниками углеводов для жвачных служат сено, солома и трава. В сухой траве примерно половину углеводов составляют фрук-тозаны и ксиланы и приблизительно столько же приходится на долю целлюлозы. Целлюлозные компоненты кормов были бы недоступны для использования, если бы у жвачных в процессе эволюции не возни кли симбиотические отношения с микробами, способными расщеплять целлюлозу (рис. 14.1).

Два первых отдела желудка жвачных - рубец и сетка-это как бы большая бродильная камера (емкостью от 100 до 250 л), в которой существуют идеальные условия для роста многочисленных микроорганизмов; им обеспечены здесь постоянная температура (37-39°С), непрерывная подача минерального рас твора (около 100-200 л слюны в сутки), хорошо забуференного бикарбонатом и фосфатом (рН 5,8-7,3), периодическое поступление питательных веществ в виде хорошо размельченного, богатого целлюлозой корма и, наконец, механическое перемешивание в результате движений рубца. Таким образом, рубец напоминает систему дляполунепрерывного культивирования микроорганизмов.

Среди обитателей рубца преобладают простейшие и бактерии. В 1 мл

содержимого рубца находится несколько миллионов простейших-главным образом инфузорий, относящихся к родам Diplodinium и Entodinium. Это специфические для рубца, мало распространенные в других местах виды. По массе они составляют от 6 до 10% содержи мого рубца, причем часть этой массы приходится на долю запасенных ими полисахаридов. Однако простейшие, возможно, не играют в рубце жизненно важной роли. Неясно, участвуют ли они в разложении целлюлозы.

С функциональной точки зрения наиболее важными обитателями рубца являются бактерии. В 1 мл рубцовой жидкости содержится от 10⁹ до 10¹⁰ бактериальных клеток. На их долю приходится 5-10% сухой массы содержимого рубца. Специфические для рубца бактерии - строгие анаэробы. Дрожжи и другие грибы присутствуют здесь лишь в неболь шом количестве.

Бактерии перерабатывают полимерные углеводы кормов в простые соединения, такие как жирные кислоты и спирты. Из целлюлозы, крах мала, фруктозана и ксилана образуются в основном жирные кислоты. По имеющимся данным, разложению подвергается около 90° ₀ (по весу) всей поступающей с кормом целлюлозы. При этом образуются боль шие количества кислот, главным образом уксусной (50-70 об. %), про-пионовой (17-21 об. %) и масляной (14-20 об. %), а также немного вале риановой и муравьиной. Кроме того, ежедневно образуется до 900 л газа примерно следующего состава (по объему): 65% С0₂, 27% метана, 7% N₂, 0,18% Н₂ и следовые количества сероводорода. Сравнительно недавно из содержимого рубца были выделены бактерии, которые и в лабораторных условиях сбраживали целлюлозу до тех же кислот и в тех же соотношениях, что и в рубце. Поэтому можно предполагать, что органические кислоты в рубце образуются в результате разложения целлюлозы бактериями.

Расщеплять целлюлозу в рубце способны Ruminococcus albus и R. flavefaciens - грам-отрицательные кокки;Bacteroides succinoqenes - грам-отрицательная неподвижная палочка, образующая главным образом ук­сусную и янтарную кислоты; Butyrivibrio fibrisolvens; Clostridium cellobioparum.

Отсутствие в рубце молочной кислоты следует приписать активно сти бактерии Veillonella alcalescens(Micrococcus lactilyticus), сбраживаю щей лактат с образованием пропионата, ацетата, молекулярного водо­рода и СО ₂- Метан не является прямым продуктом разложения целлюлозы: он имеет вторичное происхождение и образуется из жирных кислот, а также молекулярного водорода и С0₂ . Образование сероводорода в рубце связано с восстановлением сульфата бактерией Desulfotomaculumruminis. Selenomonas ruminantium сбраживает глюкозу в молочную, уксусную и пропионовую кислоты.

В местах естественного обитания жвачных-в саваннах и степях-их корм очень беден азотом и белками. Синтез белка обеспечивает симбиотическая мик рофлора рубца. Дело в том, что у жвачных сформировался весьма эффективный «желудочно-печеночный цикл». Мочевина, образующаяся в печени в процессе обезвреживания аммиака, лишь частично выводится с мочой; вся остальная мо чевина поступает через слюнные железы и стенку рубца в первые отделы желуд ка и может использоваться микроорганизмами рубца для синтеза белка (рис. 14.1). Благодаря симбиотическим взаимоотношениям с микроорганизмами рубца жвачные не зависят от экзогенных источников белка. Было неоднократно показано, что коров можно держать на безбелковом корме.

Бактерии играют в питании жвачных двоякую роль. Кислоты, обра зующиеся при распаде полисахаридов, всасываются здесь же в рубце. Сами бактерии при переходе содержимого рубца в кишечник перевари­ваются, так что вещество их клеток тоже подвергается разложению и усваивается животным. Поскольку бактерии рубца используют и неорганические источники азота, это существенно увеличивает количество белка, получаемое организмом.

Бактерии рубца подвергают растительные жиры гидрированию. Образующиеся насыщенные жирные кислоты всасываются в кишечнике, а затем включаются в собственные жиры крупного рогатого скота, входящие в состав мяса, молока и масла. У животных, не имеющих рубца, подобного повышения тугоплавкости жира не происходит. Жиры, накапливаемые в организме свиньи или грызунов, имеют поэтому более мягкую консгистенцию (более низкую температуру плавления), чем жиры жвачных; они содержат ненасыщенные жирные кислоты и кис лоты с более короткой цепью, т.е. те, которые поступают с расти тельным кормом. Если учесть, что не только жиры изменяются под влиянием бактерий рубца, но и 60-90% (по весу) белков крупного рогатого скота имеет бактериальное происхождение, то можно, поедая говяжий бифштекс, поистине чувствовать себя в гостях у бактерий, а наслаждаясь свиным шницелем-в гостях у кормовых растений!