Microbiology

Микроорганизмы используют нитрат для двух целей. Во-первых, подобно большинству растений, многие бактерии способны извлекать из него азот для синтеза азотсодержащих клеточных компонентов. Такая ассимиляционная нитратредукция может протекать и в аэробных, и в анаэробных условиях. Во-вторых, возможна также диссимиляционная нитратредукция, или «нитратное дыхание»; при этом нитрат в анаэробных условиях служит конечным акцептором водорода. В обоих случаях нитрат сначала восстанавливается до нитрита с помощью молибденсодержащего фермента нитратредуктазы.

Ассимиляция нитрата. В процессе ассимиляции нитрат сначала восстанавливается до нитрита, а затем до аммиака; последний используется для синтеза аминокислот и других азотсодержащих компонентов клетки. Первый этап катализирует нитратредуктаза; этот фермент (нитратредуктаза В) находится в цитоплазме, и его синтез индуцируется в том случае, если нитрат оказывается единственным источником азота в питательной среде. Нитрит восстанавливается до аммиака с помощью нитритредуктазы, на что затрачивается 6 электронов. Электроны поступают от NAD(P)H₂ (у грибов и бактерий) или ферредоксина (у растений и некоторых бактерий). Нитритредуктаза - сложный фермент, его каталитические центры содержат атомы железа, из которых одни входят в состав тема (сирогем), а другие связаны с атомами серы. Нитритредуктазная реакция сходна с превращениями, катализируемыми нитрогеназой и сульфитредуктазой, так как при восстановлении субстрата происходит перенос 6 электронов и не высвобождается никаких промежуточных продуктов:

2е"                           2*-          2е"             2е"

NOf   -^--  N0₂-   -^-- HN0 -^-- NHjOH -*-- NH₃

Нитратредуктаза В   Нитритредуктаза

Образование аммония из нитрата представляет собой процесс восстановления, протекающий с большими затратами восстановительной силы:

8[Н]   +   Н⁺    +   N0₃~   -  NH+   +   ОН"    +   2Н₂0

Сравнивая рост клеток в аэробных условиях на средах, содержащих в качестве источника азота нитрат или соответственно аммоний, можно заметить, что в первом случае затрачивается больше восстановительной силы (донора водорода), чем при  восстановлении  аммония  (при  одинаковом выходе  биомассы).

Нитратное дыхание: денитрификация. Денитрифицирующие бактерии обладают способностью восстанавливать нитрат через нитрит до газообразной закиси азота (N₂0) и азота (N₂):

10[Н]   +   2Н⁺   +   2N0₃^_   -» N₂   +   6Н₂0

В отсутствие кислорода нитрат, таким образом, служит конечным акцептором водорода.

 Способность получать энергию путем использования нитрата как конечного акцептора водорода с образованием молекулярного азота широко распространена у бактерий. Этот процесс денитрификации до сих пор был обнаружен только у факультативных аэробов; по-видимому, среди облигатных анаэробов нет денитрифицирующих форм. Кроме того, бактерии чаще обладают полной дыхательной системой; синтез ферментов, необходимых для денитрификации (мембраносвязанные нитратредуктаза А и нитритредуктаза), индуцируется только в анаэробных условиях (рис. 9.2). У многих денитрификаторов эта индукция происходит лишь в присутствии нитрата, хотя для некоторых достаточно создания анаэробных условий. Многие денитрификаторы могут расти, используя в качестве акцептора водорода не только нитрат, но и нитрит, а иногда даже закись азота. Из этого следует, что не только нитратредуктаза А, но и диссимиляционная нитритредуктаза связана у них с дыхательной цепью и участвует в выработке энергии.

Накопительная культура денитрифицирующих бактерий. Если в среду, содержащую доноры водорода, субстраты для построения клеточных компонентов и нитрат, внести почву или ил и инкубировать культуру без доступа воздуха, то в ней будут расти различные бактерии: а) при наличии следов пептона и этанола или пропионовой кислоты - Pseudomonas aeruginosa; б) на глюкозе - Pseudomonas fluoresceins; в) на тартрате, сукцинате или малате - Pseudomonas stutzeri; г) на среде с органическими кислотами, спиртом, мясным экстрактом и при высокой концентрации нитрата (5-12% KNO₃) - Bacillus licheniformis; д) при наличии следов дрожжевого экстракта и Н₂ в качестве донора водорода - Paracoccus denitrificans; e) в присутствии серы или тиосульфата - Thiobacillus denitrificans.

Поскольку некоторые денитрификаторы используют нитрат исключительно или преимущественно как акцептор водорода, но не могут восстанавливать его до NH4, необходимо добавлять в среду источник азота (пептон или соль аммония).

Обеднение почвы азотом вследствие денитрификации. Временные потери азота на ограниченных участках почвы, несомненно, связаны с деятельностью денитрифицирующих бактерий. Она имеет большое значение, когда в почве создаются анаэробные условия, например при застойном переувлажнении, особенно если при этом применяются органические удобрения и нитраты. На рисовых полях удобрение нитратами может приводить к вредным последствиям из-за накопления нитритов. Нитрит аккумулируется также в содержащих нитрат сточных водах при недостаточном доступе воздуха, а иногда попадает и в источники питьевой воды. Зависимость обеднения почвы азотом от аэрации связана с особенностями регуляции нитратредуцирующей ферментной системы у бактерий. Эти ферменты индуцируются нитратом только в анаэробных условиях (рис. 9.2); молекулярный кислород подавляет (репрессирует) синтез нитрат- и нитритредуктаз. В том случае, если ферменты уже были синтезированы до того, как клетки пришли в соприкосновение с кислородом воздуха, кислород вступает в конкуренцию с нитратом за электроны, поступающие из дыхательной цепи, а также подавляет функцию нитратредуцирующей системы.

Значение денитрификации в природе. Денитрификация - единственный биологический процесс, благодаря которому связанный азот преобразуется в свободный N₂. С глобальной точки зрения этот процесс имеет решающее значение для сохранения жизни на земной суше. В нормально аэрируемых почвах и водоемах нитрат представляет собой конечный продукт минерализации. Благодаря своей высокой растворимости в во­де и слабому связыванию почвой нитрат-ионы вымывались бы из почвы и накапливались в морской воде; содержание молекулярного азота в атмосфере стало бы уменьшаться, и процессы роста растений и про­дукции биомассы на суше в конце концов прекратились бы.

Нитратное дыхание: восстановление нитрата до нитрита. Для целого ряда факультативно-анаэробных бактерий (Enterobacter, Escherichia coli и др.) нитрат может служить конечным акцептором водорода в процессе транспорта электронов, поставляющем энергию. Этот вид «нитратного дыхания» отличается от денитрификации тем, что здесь только первая ступень, а именно восстановление нитрата до нитрита с по­мощью нитратредуктазы А, сопряжена с переносом электронов и преобразованием энергии:

При этом нитрит может накапливаться в культуральной жидкости - образования N₂ не происходит.

Однако вместо этого нитрит может восстанавливаться до аммиака путем ассимиляционной нитритредукции с последующим выделением NH4 в среду. В таком случае говорят об аммонификации нитрата. Вос­становление нитрита до аммиака не позволяет клетке получать энергию. Речь идет скорее о процессе брожения, в котором нитрит играет роль экзогенного акцептора электронов. Таким образом, восстановле­ние нитрита все же дает известное преимущество: при сбраживании глюкозы часть атомов водорода расходуется на восстановление нитрита, в результате чего образуется больше ацетата.

Образование метгемоглобина как следствие накопления нитрата в питьевой воде и пищевых продуктах. Употребление содержащих нитрат питьевой воды (довольно частое в засушливые периоды) и овощей (например, «переудобренного» шпината) может вследствие бактериального восстановления нитрата в консервах или в кишечнике приводить к заболеваниям. Восстановление нитрата до нитрита микроорганизмами с последующим поступлением нитрита в кровь служит причиной образования метгемоглобина, в котором кислород прочно (необратимо) связан с гемоглобином. В результате эритроциты частично утрачивают способность переносить кислород, что приводит к цианозу. Такое заболевание встречается только у детей младше 6 месяцев. У них нитратредуцирующие бактерии, по-видимому, не разрушаются в желудке и попа­дают в кишечник, где восстанавливают нитрат, растут и накапливают нитрит. У детей более позднего возраста и у взрослых такие бактерии погибают под действием сильнокислого желудочного сока, а ионы ни­трата всасываются раньше, чем они могли бы подвергнуться восстановлению при благоприятных для этого значениях рН в двенадцатиперстной кишке.