Microbiology

В то время как большинство анаэробных организмов способно синтезировать АТР только путем фосфорилирования на уровне субстрата, аэробы могут осуществлять несравненно более эффективную регенерацию АТР. Они обладают особым аппаратом: дыхательной (электрон-транс портной) цепью и ферментом ATР-синтазой; обе системы у прокариот находятся в плазматической мембране, а у эукариот – во внутренней мембране митохондрий. Ведущие свое происхождение от субстратов восстановительные эквиваленты (Н или электроны) в этих мембранах по ступают в дыхательную цепь, и электроны переносятся на О₂ (или другие терминальные акцепторы электронов). В дыхательной цепи происходят реакции, представляющие собой биохимический аналог сгорания водорода. От химического горения молекулярного водорода они отличаются тем, что значительная часть свободной энергии переводится при этом в биологически доступную форму, т. е. в АТР, и лишь небольшая доля рассеивается в виде тепла.

Механизм окислительного фосфорилирования. Отданные субстратами восстановительные эквиваленты (протоны и электроны) переносятся на плазматическую мембрану или на внутреннюю мембрану митохондрий. Через мембрану они транспортируются таким образом, что между внутренней и внешней сторонами мембраны создается электрохимический градиент с положительным потенциалом снаружи и отрицательным внутри (рис. 7.8). Этот перепад заряда возникает благодаря определенному расположению компонентов дыхательной цепи в мембране.

Некоторые из этих компонентов переносят электроны, другие переносят водород. Взаиморасположение переносчиков в мембране таково, что при транспорте электронов от субстрата к кислороду протоны (Н ⁺) связываются на внутренней стороне мембраны, а освобождаются на внешней. Можно представить себе, что электроны в мембране проходят зигзагообразный путь и при этом переносят протоны изнутри наружу. Эта система, транспортирующая электроны и протоны, получила название дыхательной или электронтранспортной цепи. Иногда ее образно называют «протонным насосом», так как главная функция этой системы - перекачивание протонов.

Неравновесное распределение зарядов, т.е. электрохимический градиент, служит движущей силой для процесса регенерации АТР (и других процессов, требующих затраты энергии). Мембрана содержит специальный фермент АТР-синтазу, синтезирующий АТР из ADP и Pj. Этот фермент выступает из мембраны с ее внутренней стороны. В процессе синтеза АТР протоны переходят обратно с наружной стороны мембраны на внутреннюю. Синтез АТР за счет энергии транспорта электронов через мембрану называют окислительным фосфорилированием или фосфорилированием в дыхательной цепи.

Для того чтобы понять механизм дыхания, необходимо знать 1) компоненты дыхательной цепи, 2) их окислительно-восстановительные потенциалы и 3) их взаиморасположение в мембране.

Мембраны как место осуществления дыхания. Компонентами дыхательной цепи являются ферментные белки с относительно прочно связанными низкомолекулярными простетическими группами. Давнюю мысль о том, что «дыхание» - это катализ, осуществляемый железом на поверхностях» (О. Варбург), можно считать справедливой. Действительно, ферменты дыхательной цепи структурно связаны. У эукариот они локализуются во внутренней мембране митохондрий, а у прокариот – в плазматической мембране. Механизм действия и локализация компонентов дыхательной цепи в тех и других мембранах во многом сходны. Дыхательная цепь Alcaligenes eutrophus и Paracoccus denitrificans почти идентична дыхательной цепи митохондрий.

Компоненты дыхательной цепи погружены в двойной липидный слой. Речь идет о большом числе ферментов, коферментов и простетических групп, различных дегидрогеназ и транспортных систем, участвующих в переносе электронов и водорода. Белковые компоненты могут быть выделены из мембраны. Важнейшие из компонентов, участвующих в окислении водорода, - это флавопротеины, железосерные белки, хиноны и цитохромы.

Флавопротеины представляют собой ферменты, содержащие в качестве простетических групп флавинмононуклеотид (FMN) или флавинадениндинуклеотид (FAD). Эти ферменты переносят водород. Активной группой в них является изоаллоксазиновая система (рис. 7.9, А), которая действует как обратимая окислительно-восстановительная система. Реагирующими центрами служат два атома азота, каждый из которых может связаться с одним [Н]. Связывание может происходить в два этапа через состояние семихинона. Благодаря способности переносить то по два атома водорода, то по одному флавопротеины могут быть посредниками между двумя типами процессов переноса водорода.

Железосерные белки - это окислительно-восстановительные системы, переносящие электроны. Они содержат атомы железа, связанные, с одной стороны, с серой аминокислоты цистеина, а с другой - с неорганической сульфидной серой (рис. 7.9, Б). Последняя очень легко отщепляется в виде сероводорода при подкислении. Остатки цистеина входят в состав полипептидных цепей; Fe-S - центры можно рассматривать как простетические группы полипептида. Участвующие в дыхательной цепи [2Fe + 2S]-центры способны переносить только один электрон. Железосерные белки типа [2Fe + 2S], имеющие по два атома лабильной серы и железа, содержатся в нескольких ферментных комплексах дыхательной цепи. Из общего количества находящегося в плазматической мембране железа 80% содержится в Fe-S-белках и только 20% - в цитохромах.

Помимо транспорта электронов в мембранах Fe-S-белки участвуют в фиксации молекулярного азота, в восстановлении сульфита и нитрита, в фотосинтезе, в освобождении и активации молекулярного водорода и в окислении алканов. Fe-S-белки имеют относительно низкую молекулярную массу и сильно отрицательный окислительно-восстановительный потенциал; величины Е, находятся в пределах от - 0,2 до - 0,6 В. Помимо железосерных белков с [2Fe 4-+ 2S]-центрами (в хлоропластах, у аэробных бактерий) существуют и другие - с [4Fe 4- 4S] - центром (у Clostridium, Chromatium). а также такие, которые содержат по два [4Fe + 4S] - центра (у Clostridium, Azotobacter). Железосерные белки получили название по своему происхождению или по функции: ферредоксин, путидаредоксин, рубредоксин, адренодоксин

 Еще одну группу окислительно-восстановительных систем в дыхательной цепи составляют хиноны. Во внутренней мембране митохондрий и у грам-отрицательных бактерий имеется убихинон (кофермент Q; рис. 7.9, В), у грам-положительных бактерий -нафтохиноны, а в хлоропластах - пластохиноны. Хиноны, в частности убихинон, липофильны и поэтому локализуются в липидной фазе мембраны. Они способны переносить водород или электроны. Перенос может осуществляться в два этапа, при этом в качестве промежуточной формы выступает семихинон. По сравнению с другими компонентами дыхательной цепи хиноны содержатся в 10-15-кратном избытке. Они служат «сборщиками» водорода, поставляемого различными коферментами и простетическими группами в дыхательной цепи, и передают его цитохромам.

Цитохромы - окислительно-восстановительные системы, переносящие только электроны; водород они не транспортируют. К цитохромам электроны поступают от пула хинонов. При переносе электронов эквивалентное им число протонов переходит в раствор. В качестве простетической группы цитохромы содержат гем (рис. 7.9). Центральный атом железа геминового кольца участвует в переносе электронов, изменяя свою валентность. Цитохромы окрашены; они отличаются друг от друга спектрами поглощения и окислительно-восстановительными потенциалами. Различают цитохромы а, а_b,b, с, о и ряд других. В цитохроме с группы гема ковалентно связаны с цистеиновыми остатками апопротеина; благодаря такой прочной связи он растворим в воде и его можно экстрагировать из мембраны солевыми растворами. Цитохром с найден почти у всех организмов, обладающих дыхательной цепью. Что касается распространенности других цитохромов, то тут существуют заметные различия.

Цитохромы участвуют также в переносе электронов на кислород. Цитохромоксидаза (цитохромаа_b) - терминальная оксидаза, реагирующая с кислородом и передающая ему четыре электрона:

0₂   +   4Fe²⁺   -►   20²"   +   4Fe^3 +

Часто встречающийся у бактерий цитохром о также может реагировать с молекулярным кислородом. Эта терминальная оксидаза может быть ингибирована цианидом или окисью углерода.

Наличие цитохромов долгое время рассматривалось как признак принадлежности к аэробным или фототрофным организмам. Открытие цитохрома с₃ у Desulfovibrio вначале казалось неожиданным, но затем стало понятно, что воcстановление сульфата этими сульфатредуцирующими бактериями позволяет им осуществлять окислительное фосфорилирование в анаэробных условиях и, таким образом, формально соответствует дыханию. Недавно выявилось, что аэротоле рантные молочнокислые бактерии Streptococcus lactis и Leuconostoc mesenteroidesи анаэроб Bifidobacterium тоже синтезируют цитохромы, если растут на средах, содержащих гемин или кровь. Цитохромы были обнаружены также у строгих анаэробов Selenomonas ruminantium, Veillonellaalcalescens, Vibrio succinogenes, Clostridium formicoaceticum и С. thermoaceticum. Вполне возможно, что и у некоторых других строго анаэробных бактерий будут найдены цитохромы и способность в какой-то мере осуществлять фосфорилирование, сопряженное с транс портом электронов.