Microbiology

ДНК /ДНК-гибридизация: гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК разных видов. Как мы уже говорили, при нагревании изолированной ДНК две полинуклеотидные цепи расходятся в результате разрыва водородных связей. Такая денатурация (или «плавление»), при водящая к образованию одиночных цепей, обратима: при очень медленном охлаждении препарата будет происходить спаривание и реассоциация комплементарных участков. Если смешать короткие фрагменты денатурированных ДНК, полученных из двух различных, но близких между собой видов бактерий, при температуре выше точки их плавления и затем медленно охладить смесь, тоже будет происходить реассоциация. Двойные спирали, образовавшиеся из одиночных цепей ДНК двух разных организмов, называют гетеродуплексными молекулами. Для того чтобы в эксперименте можно было проследить за образованием гетеродуплексов, нужно, конечно, пометить ДНК одной из бактерий тяжелым или радиоактивным изотопом.

Если, например, вырастить культуру одной из бактерий на тяжелой воде (D₂О), то у нее будет «тяжелая» ДНК, и тогда образование гетеродуплекса можно будет выявить путем центрифугирования в градиенте плотности CsCl - так же, как в опыте Меселсона и Сталя было доказано образование ¹⁴N - гибридной ДНК. Можно, однако, пометить ДНК одного из партнеров, выращивая его на среде с ¹⁴С или с ³²Р. Если теперь смешать длинные отрезки денатурированной ДНК (из непомеченной ¹⁴С бактерии А) с короткими отрезками денатурированной ДНК (из помеченной ¹⁴С бактерии В), медленно охладить смесь и провести ее через фильтр, задерживающий длинные цепи, но пропускающий короткие, то на фильтре останутся молекулы гетеродуплекса. Оставшаяся на фильтре радиоактивность будет тем выше, чем больше радиоактивных отрезков (В) связалось с А-цепями, т.е. она будет зависеть от того, идентичны ли (либо очень сходны) последовательности оснований ДНК А и В или же они совсем различны. Таким образом, реассоциация ДНК/ДНК дает возможность определять степень гомологии последовательностей ДНК разного происхождения. Контрольный опыт проводят с молекулами ДНК из одних и тех же бактерий (одну пробу метят, другую не метят) и произвольно принимают степень реассоциации за 100. Степень реассоциации молекул ДНК из различных штаммов выражают затем в процентах от этой величины. Рутинные методы определения гомологии между ДНК различных штаммов бактерий многократно видоизменялись, но все они основаны на том же принципе образования гетеродуплексов; во всех случаях необходимо пометить одного из партнеров.

Гомологичность ДНК, т.е. совпадение последовательности оснований в молекулах ДНК двух разных штаммов бактерий, тем больше, чем ближе родство этих штаммов между собой. Этот способ оправдал себя при сравнении близких штаммов и видов; между родами же, находящимися между собой в отдаленном родстве, степень гомологии ДНК слишком мала, чтобы можно было выявить образование гетеродуплексов. Одноцепочечная ДНК может реассоциировать и с РНК. Поэтому описанные методы позволяют также оценивать гомологию между ДНК и РНК.

Плазмиды. Многие бактерии наряду с хромосомной ДНК содержат и внехромосомную ДНК, тоже представленную двойными спиралями, замкнутыми в кольцо. Эти автономно реплицирующиеся элементы ДНК называют плазмидами.