Microbiology

Малые размеры бактериальной клетки и наличие двух типов нуклеиновых кислот очень затруднили цитохимическое выявление ядерного материала. Тем не менее классические цитологические методы, а затем и техника ультратонких срезов в сочетании с электронной микроскопией позволили в конце концов установить, что бактерии содержат ДНК и что эта ДНК не распределена диффузно в цитоплазме, а локали­зована в ограниченных участках, которые делятся перед делением клетки.

Цитологическое выявление бактериального ядра. Способность ДНК к специфическому окрашиванию лежит в основе реакции Фёльгена на ядерное вещество. В результате взаимодействия свободных альдегидных групп с бесцветной фуксинсернистой кислотой появляется фиолетовая окраска, свойственная основному фуксину. Для удаления из клеток РНК и освобождения альдегидных групп дезоксипентозы, входящей в состав ДНК, клетки предварительно обрабатывают горячей разведенной НСl (4 мин в 1 М НСl при 60°С). Лучшие результаты получались при окрашивании клеток после такой же предварительной обработки основным красителем Гимза. В дальнейшем методы фиксации были усовершенствованы; РНК стали удалять с помощью рибонуклеазы. Таким способом удалось получить препараты Escherichia coli, Bacillus cereus var.mycoides и В. megaterium, позволившие сделать вывод, что у бактерий существуют особые образования, сходные с ядром. Их называют хроматиновыми тельцами, ну-клеоидами или эквивалентами ядра (рис. 2.7 и 2.8).

К решению вопроса о структуре бактериального ядра удалось при близиться только благодаря электронной микроскопии ультратонких срезов через бактериальную клетку. Для получения оптимальной картины нативной тонкой структуры клеточного ядра решающее значение имела надлежащая фиксация (с помощью четырехокиси осмия, уранилацетата или фосфорновольфрамовой кислоты) в совершенно определенных условиях. Область ядра (нуклеоплазма) в бактериальной клетке равномерно заполнена очень тонкими нитями (рис. 2.5). В электронном микроскопе она выглядит менее плотной, чем окружающая цитоплазма, содержащая рибосомы. Какой-либо мембранной структуры, отделяющей область ядра от цитоплазмы, выявить не удалось.

Радиоавтография. То, что ядерный материал состоит из ДНК и, например, у Escherichia coli представлен единственной нитью длиной около 1 мм, замкнутой в кольцо, впервые удалось показать Кэрнсу с помощью метода радиоавтографии. Для этого были использованы препараты клеток, выращенных на среде с тимидином (предшественник тимина), меченным тритием (³Н). ДНК - единственное вещество в клетке, содержащее тимин. Если клетки, включившие ³Н в тимин, обработать лизоцимом или лаурилсульфатом на мембранном фильтре с целью вызвать их лизис, то можно получить радиоавтограф развернутой бак­териальной хромосомы. Такие радиоавтографы (рис. 2.9) убедительно доказывают, что бактериальная ДНК имеет форму нити, замкнутой в кольцо. Эта нить в генетическом смысле соответствует группе сцепления и называется бактериальной хромосомой. Кроме того, радиоавтографы позволяют представить себе способ деления такой нити. На рис. 2.10 изображена ДНК бактериофага, выявленная другим методом.