Как уже упоминалось, частота мутаций для многих признаков очень мала. Для большинства изученных до сих пор физиологических призна ков, связанных с типом метаболизма, она варьирует в пределах от 10" 10 до 10 ~5. При частоте 10 ~8 потребовалось бы обследовать 100 миллионов клеток или их потомство, чтобы выявить новых мутантов. Хотя под влиянием мутагенов частота мутаций значительно возрастает, все равно затрата труда, необходимая для их обнаружения, была бы очень велика. Поэтому перед прямым отбором осуществляют обогаще ние популяции мутантами.
Получить накопительную культуру мутантов, устойчивых к антибио тикам, ядам или бактериофагам, довольно легко. На среде, к которой добавлен соответствующий агент, выживают только устойчивые к нему мутанты, а клетки дикого типа гибнут.
Методы накопления ауксотрофных мутантов основаны на одном об щем принципе: для клеточной суспензии создают такие условия, при ко торых подлежащие выделению мутанты не растут, а растущие прото-трофные клетки отсеиваются или уничтожаются. Существуют средства, которые действуют только на растущие клетки, а нерастущим, «покоя щимся», не причиняют вреда. После удаления антимикробного агента и добавления необходимых факторов роста начинают расти ауксо трофные клетки.
Накопление мутантов с применением пенициллина. При накоплении ауксотрофных мутантов Е. coli используют пенициллин. Он убивает растущие клетки дикого типа, а нерастущие мутантные клетки при этом выживают (рис. 15.9).
После воздействия, индуцирующего мутации, и многочасового роста бакте риальную суспензию инкубируют в среде с глюкозой, но без азота. Это делается для того, чтобы дать возможность клеткам использовать оставшиеся раство римые соединения азота. Через несколько часов добавляют пенициллин и суль фат аммония и проводят инкубацию (на этот раз продолжительностью до 24 ч.). Прототрофные родительские клетки растут, и пенициллин их убивает, тогда как ауксотрофные мутанты, нуждающиеся в определенной аминокислоте, не растут, и это позволяет им уцелеть. Затем суспензию освобождают от пенициллина промыванием или добавлением пенициллиназы и высевают на агаризованную сре ду, содержащую аминокислоты. Среди вырастающих в таких условиях бактерий процент ауксотрофных клеток оказывается более высоким (помимо них растут также прототрофные клетки, выдержавшие обработку пенициллином). Если бак терии устойчивы к пенициллину, то с той же целью можно применить другие антибиотики (новобиоцин, циклосерин. колистин, канамицин). Для избиратель ного уничтожения растущих клеток используют и такое явление, как «летальный синтез».
С помощью подобных приемов удается накапливать и выделять му тантов с разного рода дефектами: с нарушениями процессов транспорта или использования субстрата, с дефектами промежуточного обмена, с повышенной чувствительностью к температуре («условно летальные» мутанты). Позднее мы опишем технику выделения других мутантов с измененной регуляцией метаболизма. В табл. 15.2 приводятся краткие сведения о методах отбора и идентификации различных типов мутан тов, в том числе и мутантов с дефектами регуляции.
