Microbiology

Бактерии с химически синтезированным геномом (на фото) быстро размножаются и внешне практически не отличаются от «диких» бактерий Mycoplasma mycoides. Изображение из обсуждаемой статьи в Science

Сотрудники института Крейга Вентера (J. Craig Venter Institute) сообщили об успешном создании первых микроорганизмов с искусственным геномом. Собранный из химически синтезированных фрагментов ДНК геном взял под контроль живые бактериальные клетки, в которые его внедрили, после чего все их свойства стали соответствовать содержащимся в нём «инструкциям». Это достижение, на которое было потрачено 40 млн долларов и 15 лет работы, позволяет надеяться, что не за горами создание микробов с нужными человеку свойствами, в том числе эффективных производителей вакцин, антибиотиков и дешевого топлива.

Крейг Вентер и его коллеги уже 15 лет упорно двигаются к великой цели — созданию искусственных микробов с заданными свойствами. В 1995 году они отсеквенировали геном бактерии Mycoplasma genitalium — обладателя самого маленького генома среди организмов, способных самостоятельно размножаться в лабораторной культуре (меньше геномы только у бактерий — внутриклеточных симбионтов и паразитов).

В ходе дальнейшей работы было показано, что из примерно 500 генов M. genitalium более сотни не являются жизненно необходимыми. Их можно по одиночке удалять или выводить из строя, и это не сказывается на жизнеспособности бактерии. Эти исследования позволили приблизительно очертить минимальный набор генов, необходимый для поддержания жизни и размножения бактерии в лабораторных условиях.

В дальнейшем команда Вентера отказалась от M. genitalium как основного объекта, потому что эта бактерия слишком медленно размножается. Ученые переключились на более быстро растущий вид — M. mycoides. Его геном был взят за основу при проектировании первых искусственных геномов, а на роль реципиента (бактерии, в которую будут внедрять синтетический геном) выбрали еще один вид микоплазм — M. capricolum.

В 2007 году исследователи добились замечательного успеха, о котором рассказано в заметке Первая в мире операция по пересадке генома позволила превратить один вид бактерий в другой («Элементы», 02.07.2007). Хромосому M. mycoides, тщательно очищенную от примесей, удалось пересадить в клетки M. capricolum. По-видимому, в бактериальных клетках сначала находились хромосомы обоих видов, но при делении некоторые из дочерних клеток унаследовали только донорскую хромосому. Эти клетки по всем своим свойствам соответствовали виду M. mycoides. Таким образом, удалось при помощи пересадки генома трансформировать один вид бактерий в другой.

Следующий важный рубеж был преодолен в 2008 году, когда команда сообщила об успешной сборке полного геномаM. genitalium из химически синтезированных фрагментов (Gibson et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome // Science. 2008. V. 319. P. 1215–1220). Молекулы ДНК длиной в несколько тысяч пар нуклеотидов (п.н.) сегодня изготавливаются на заказ биотехнологическими фирмами, такими как Blue Heron. Вы даете такой фирме последовательность нуклеотидов в виде текстового файла, платите деньги и получаете нужную молекулу хоть в чистом виде, хоть в виде плазмиды, вставленной в живую кишечную палочку. Но вот правильно собрать из таких фрагментов крупные молекулы длиной в сотни п.н., а тем более целый бактериальный геном — задача технически довольно сложная (размер генома M. genitalium — около 600 тысяч п.н., M. mycoides — миллион п.н.).

Вентер и его коллеги разработали эффективную, хотя и трудоемкую технологию такой сборки. Сначала заказываются нужные фрагменты ДНК с перекрывающимися 80-нуклеотидными концевыми участками. Затем десяток соседних фрагментов внедряют в дрожжевые клетки, где благодаря наличию перекрывающихся концов происходит их объединение в правильном порядке. Полученные более крупные фрагменты ДНК переносят в кишечную палочку, размножают, затем снова внедряют в дрожжи, где происходит их объединение в еще более крупные фрагменты, и так далее.

Авторам пришлось преодолеть немало технических трудностей, прежде чем они смогли изготовить синтетический геном M. genitalium, а затем и вдвое более крупный геном M. mycoides. Например, как отделить выделенные из дрожжей синтетические бактериальные хромосомы от ДНК самих дрожжей? Авторы использовали то обстоятельство, что бактериальные хромосомы кольцевые, а хромосомы дрожжей — линейные. Нужные молекулы «ловили» при помощи расплавленной агарозы, волокна которой при застывании проходят сквозь кольцевые молекулы ДНК и фиксируют их в агарозном геле, тогда как линейные молекулы ДНК дрожжей остаются незафиксированными, и их можно убрать из геля при помощи электрофореза.

В 2009 году был сделан следующий шаг: удалось наладить пересадку в клетки M. capricolum геномов M. mycoides, которые были модифицированы и размножены в клетках дрожжей (Lartigue et al. Creating Bacterial Strains from Genomes That Have Been Cloned and Engineered in Yeast // Science. 2009. V. 325. P. 1693–1696). На этом этапе необходимо было научиться преодолевать естественную защиту бактерий (в данном случае M. capricolum) от внедрения чужеродной ДНК. У M. capricolum есть система рестрикции-модификации, которая метилирует определенные последовательности нуклеотидов в своей собственной хромосоме и уничтожает схожие последовательности, если они не метилированы. Когда авторы в 2007 году пересадили геном M. mycoides в клетки M. capricolum, клетки-реципиенты восприняли донорскую ДНК как «свою», потому что системы рестрикции-модификации у двух видов сходны. В клеткахM. mycoides ДНК метилируется примерно так же, как и у M. capricolum; метилирование сохраняется при пересадке, и поэтому защитная система не срабатывает. Однако бактериальные хромосомы, размноженные в дрожжах, не метилированы, и поэтому клетки M. capricolum считают их «чужими» и пытаются уничтожить. Чтобы справиться с этой проблемой, пришлось отключить у реципиентов систему рестрикции.

Теперь оставалось лишь совместить результаты, описанные в статьях 2008-го и 2009 года, то есть синтезировать искусственный геном M. mycoides и пересадить его из дрожжей в M. capricolum. Первая попытка закончилась неудачей. Хотя всё было сделано предельно аккуратно, искусственный геном не приживался в клетках-реципиентах. Это означало, что в синтезированную авторами генетическую «программу» на каком-то этапе сборки вкралась ошибка. Ее поиск задержал работу на три месяца. Исследователям пришлось тестировать фрагменты синтетического генома поодиночке, вставляя в клетки M. capricolum комбинированные хромосомы M. mycoides, содержащие по одному синтетическому фрагменту, тогда как остальная часть хромосомы была «натуральная», то есть происходила от живых бактерийM. mycoides. Наконец ошибку нашли: как выяснилось, дело было в том, что выпал один-единственный нуклеотид из жизненно важного гена dnaA. Этот ген необходим для репликации (размножения) ДНК. Потеря нуклеотида привела к сдвигу рамки считывания и превратила генетическую инструкцию в бессмыслицу.

В итоге все трудности остались позади, и 20 мая на сайте журнала Science появилось сенсационное сообщение о создании первых живых существ с синтетическим геномом. Как и в прошлых опытах по пересадке генома, клетки-реципиенты полностью перестроились, подчинившись инструкциям, записанным в их новой синтетической хромосоме. В них не осталось ничего от исходных бактерий M. capricolum: все белки и все свойства клеток стали соответствовать новому геному.

Колонии бактерий с синтетическим геномом (вверху) окрашены в синий цвет, потому что их геном содержит ген lacZ, кодирующий фермент бета-галактозидазу. В питательной среде есть вещество X-gal, превращаемое этим ферментом в синий краситель (5,5'-дибромо-4,4'-дихлоро-индиго). «Дикие» бактерии M. mycoides (внизу) не имеют этого гена, поэтому их колонии остаются белыми. Рисунок из обсуждаемой статьи Gibson et al. в Science

Можно ли называть этих бактерий «синтетическими», «искусственными» — вопрос скорее философский, чем биологический. Некоторые эксперты считают, что нельзя, потому что цитоплазма бактерии-реципиента, в которую был вставлен искусственный геном, не была синтетической. Вентер считает, что можно, потому что после пересадки цитоплазма полностью преобразовалась в соответствии с новым геномом. Ведь генетическое «программное обеспечение», в отличие от компьютерного, само создает себе всё необходимое «железо». Собственно, в прямом экспериментальном доказательстве этого принципа (в котором биологи и без того были уверены на основе более косвенных фактов) и состоит основное философское и мировоззренческое значение работ команды Вентера.

Бактерии с синтетическим геномом нормально живут и размножаются, причем даже немного быстрее, чем некоторые «натуральные» штаммы M. mycoides. Синтетический геном почти не отличается от естественного генома M. mycoides, если не считать нескольких удаленных генов и четырех специально добавленных фрагментов, которые авторы называют «водяными знаками». Эти фрагменты не кодируют белков и не влияют на работу генома. В них условным нуклеотидным кодом записаны имена и электронные адреса ведущих участников проекта. Вентер и его коллеги подчеркивают, что вставлять такие «водяные знаки» в синтетические геномы необходимо, чтобы потом можно было отличить искусственные геномы от естественных.

Из «синтетических микробов» выделили многострадальный геном и отсеквенировали его, чтобы понять, что же в итоге получилось. Было найдено несколько мутаций (нуклеотидных замен), возникших в ходе сборки, которые, по-видимому, не отразились на жизнеспособности бактерий. Один ген, не являющийся жизненно необходимым, был выведен из строя мобильным генетическим элементом (транспозоном), характерным для E. coli. Транспозон успел встроиться во фрагмент синтетического генома, когда тот подвергался клонированию в кишечной палочке. Еще один ген вышел из строя из-за случайно возникшей дупликации (удвоения) фрагмента ДНК длиной в 85 нуклеотидов. В общей сложности в синтетическом геноме удалено или испорчено 14 генов, имеющихся у «диких» M. mycoides.

Важность данной работы в том, что она показала принципиальную возможность целенаправленного проектирования микроорганизмов и техническую осуществимость всех этапов процесса. Для первого раза серьезных изменений в текст генома M. mycoides вносить не стали, но всё еще впереди. В принципе, теперь можно проектировать геном на компьютере, переводить его в формат ДНК и загружать генетическую программу в цитоплазму живой клетки. Выполнение начнется автоматически.

У методики, разработанной Вентером и его коллегами, пока много ограничений. После трансплантации генома в течение какого-то времени в бактериальной клетке присутствует смесь «старых» белков, закодированных в геноме клетки-реципиента, и «новых», закодированных в имплантированном геноме. Очевидно, эти белковые комплекты не должны конфликтовать друг с другом, чтобы клетка могла пережить переходный период. Что будет, если вставить вM. capricolum геном, сильнее отличающийся от ее собственного, чем геном близкого вида M. mycoides? Скорее всего, в недалеком будущем мы узнаем об этом из новых статей Вентера и его коллег.

Что касается опасений, высказываемых некоторыми экспертами относительно новых возможностей для биотерроризма, то об этом пока можно не беспокоиться. Разработанные авторами методы слишком сложны и дороги, чтобы представлять хоть какой-то интерес для злоумышленников. Создание первого «искусственного микроба», абсолютно ничем не примечательного, кроме самого факта своей искусственности, обошлось в 40 млн долларов и 15 лет работы высокопрофессионального коллектива из двух-трех десятков человек. Скорее уж террористы заинтересовались бы сравнительно дешевыми технологиями создания синтетических вирусов, известными с 2002 года (J. Cello, A. V. Paul, E. Wimmer. Chemical Synthesis of Poliovirus cDNA: Generation of Infectious Virus in the Absence of Natural Template //Science. 2002. V. 297. P. 1016–1018).

Более серьезные опасения вызывает намерение возглавляемой Вентером компании Synthetic Genomic, которая финансировала проект, запатентовать новооткрытые методики. Не станет ли Synthetic Genomic монополистом в производстве «софта» для искусственных микробов, подобно Майкрософту?

 Источники: